Эцио Аудиторе да Фиренце приезжает в Константинополь в 1511 году — старый ассасин, ищущий пять ключей, которые открывают библиотеку, запечатанную под Масиафом Альтаиром два с половиной века назад. Ключи разбросаны по османской столице, разрываемой притязаниями на престол принцев Ахмета и Селима, а византийские тамплиеры действуют против города; поиски ведут от башни Галата и Айя-Софии к дворцу Топкапы, дальше на Девичью башню в Босфоре и, в конце, в крепость византийских тамплиеров под Каппадокией.
Маршрут начинается в Масиафе в Сирии и ведёт за Эцио по настоящему Стамбулу из игры — башня, храм, дворец и островок, которые можно посетить и сегодня, — а заканчивается под землёй в Каппадокии.
Декабрь 1499 года: армия Чезаре Борджиа обрушивается на виллу Аудиторе в Монтериджони, убивает Марио и забирает Яблоко Эдема. Assassin's Creed Brotherhood отправляет Эцио в Рим, центр власти тамплиеров, чтобы дать бой тамплиерам Борджиа, а погоня за Яблоком ведёт от собора Святого Петра до храма, скрытого под Колизеем.
Маршрут идёт за Эцио от виллы в Монтериджони по Риму Борджиа — замок Святого Ангела, Пантеон, собор Святого Петра и Колизей — до Вианы в Наварре, в Испании, где его схватка с Чезаре заканчивается на крепостной стене. Каждая остановка — настоящее место, которое можно посетить.
Флоренция, 1476 год: юный Эцио Аудиторе видит, как его отца и братьев вешают по ложному обвинению, и следующую четверть века охотится на виновных — по Тоскане, Романье и Венеции, вплоть до самого Ватикана. Игра Ubisoft 2009 года воссоздала Италию Возрождения так, чтобы по ней можно было лазать и бегать по крышам, а вымышленную вражду ассасинов и тамплиеров смешала с настоящими людьми: Медичи и Пацци, Леонардо да Винчи, Катериной Сфорцей и папой из рода Борджиа.
Маршрут проходит по настоящим зданиям и городам игры. Семья Аудиторе и её вилла вымышлены; большинство окружающих их событий придумано или переставлено по сравнению с историей.
